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致病疫霉 NLP 家族基因 PiNLP30的克隆、原核表达及蛋白质纯化
作者: 朱丽丹 ; 朱杰华 ; 赵冬梅 ; 杨志辉 ; 徐进
关键词: 致病疫霉 PiNLP30 基因 序列分析 原核表达 蛋白质纯化
摘要:为了制备致病疫霉 NLP 家族中 PiNLP30蛋白的多克隆抗体,根据 GenBank 中 PiNLP30的cDNA 序列及原核表达载体 pET28b 中的多克隆位点设计引物,对 PiNLP30基因进行 RT PCR 扩增和重组质粒 pET28b PiNLP30的构建,将重组质粒在大肠杆菌 BL21(DE3)表达体系中进行诱导表达,通过 SDS PAGE 检测蛋白质表达,并利用镍琼脂糖亲和层析进行蛋白质纯化。克隆和序列分析显示,该基因 cDNA 全长714 bp,编码237个氨基酸。该基因编码蛋白质是一个主要由不规则卷曲组成的亲水蛋白,含有一段19个氨基酸的信号肽序列。预测蛋白质分子量为26.6 kD,等电点5.49。经PCR、酶切及测序验证,成功构建了原核表达载体 pET28b PiNLP30,使用0.6 mmol/L IPTG 于37℃下诱导6 h 后蛋白质大量表达,表达的蛋白质主要以包涵体形式存在。经镍琼脂糖亲和层析进行纯化,获得了纯化的 PiNLP30蛋白,其质量浓度约为0.3 mg/mL。
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